RNA-seq em Lote (Bulk RNA-seq)

Visão Geral

Esta habilidade prepara leituras de RNA-seq em lote e a saída de quantificação para uma comparação reprodutível em nível de gene. Ela cuida da validação de amostras, receitas de leituras para contagens e a entrega de contagens/metadados; o ajuste estatístico e o enriquecimento subsequentes permanecem em suas habilidades especializadas.

"Defensável" significa três coisas, aplicadas em todo o processo:

• Reprodutível — versões fixadas de pipelines/ferramentas, contêineres quando possível, parâmetros registrados, sementes aleatórias fixas.
• Com controle de qualidade — o controle de qualidade (QC) é inspecionado e agido antes, durante e após a quantificação, não pulado.
• Estatisticamente sólido — replicação adequada, um design que corresponde à biologia, contagens tratadas corretamente e testes com controle de FDR.

O pipeline é: FastQC/trim → align/quant (STAR/Salmon) → counts → DE (pydeseq2) → enrichment (pathway-enrichment) → figures.

Quando Usar Esta Habilidade

Use esta habilidade quando o usuário quiser:

• Ir de arquivos FASTQ (ou uma execução de sequenciamento) para genes e vias diferencialmente expressos.
• Executar ou configurar nf-core/rnaseq, ou alinhar/quantificar com STAR, Salmon ou featureCounts.
• Transformar a saída de Salmon/STAR/featureCounts em uma matriz de contagens pronta para DESeq2/PyDESeq2.
• Projetar ou verificar um experimento de RNA-seq em lote (réplicas, lote, polaridade) antes de comprometer o processamento.
• Escalar uma análise de RNA-seq de ponta a ponta e decidir quais ferramentas e habilidades encadear.

Este é RNA-seq em lote (amostras = espécimes biológicos). Para dados de célula única/núcleo use scanpy; para as estatísticas de DE sozinhas use pydeseq2; para enriquecimento sozinho use pathway-enrichment.

O Pipeline em Resumo

flowchart TD
    fastq["Raw FASTQ + samplesheet"] --> qc["FastQC + MultiQC"]
    qc --> trim["Trim: fastp / Trim Galore"]
    trim --> align["Align + quant: STAR and/or Salmon"]
    align --> counts["Gene-level counts matrix"]
    counts --> de["Differential expression"]
    de --> enrich["Pathway / GSEA enrichment"]
    de --> fig["Figures"]
    enrich --> fig
    nfcore["nf-core/rnaseq via nextflow skill"] -.->|"path A"| align
    manual["Standalone recipes (this skill)"] -.->|"path B"| align
    bridge["build_counts_matrix.py (this skill)"] -.-> counts
    pydeseq2skill["pydeseq2 skill"] -.-> de
    pwskill["pathway-enrichment skill"] -.-> enrich
    vizskill["scientific-visualization skill"] -.-> fig

Dois Caminhos de Entrada — Escolha Um

O estágio de leituras → contagens pode ser executado de duas maneiras. Ambos produzem contagens em nível de gene, mas STAR/featureCounts e Salmon/tximport geralmente não fornecem valores idênticos ou intercambiáveis: as regras de atribuição, mapeamentos múltiplos e correções de comprimento efetivo diferem. Escolha uma rota de quantificação para toda a comparação.

Quando em dúvida, prefira o Caminho A: nf-core/rnaseq já conecta FastQC → trimming → STAR/Salmon → quantificação → tximport → MultiQC com padrões razoáveis e revisados, que é a opção mais defensável. O Caminho B existe para transparência e configurações restritas.

Ambos os caminhos convergem para uma matriz de contagens em nível de gene. Preserve se as contagens são brutas ou escaladas por comprimento, a versão do mapeamento transcrito-para-gene e quaisquer offsets. Contagens escaladas por comprimento não devem receber uma segunda correção de comprimento de transcrito.

Configuração

# This skill's glue (bridge + handoffs) — Python
uv pip install "pytximport==0.13.0" pandas numpy

# Downstream skills install their own deps:
#   pydeseq2 skill           -> uv pip install pydeseq2
#   pathway-enrichment skill -> uv pip install gseapy gprofiler-official

# Path A (nf-core): only Nextflow + a container engine are needed — see the `nextflow` skill.

# Path B (standalone tools): install via bioconda. Pin versions for reproducibility.
conda create -n rnaseq -c conda-forge -c bioconda --strict-channel-priority \
  fastqc fastp trim-galore "star=2.7.11b" "salmon=2.8.0" subread multiqc

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