Microscopia quantitativa com CellProfiler

Use esta habilidade quando um usuário precisar de um .cppipe repetível do CellProfiler, contagens nucleares, fluorescência nuclear ou medições de microscopia em lote. O ensaio agrupado aceita um canal nuclear TIFF 2D em tons de cinza por campo, com pixels preto-é-zero (MINISBLACK) e núcleos brilhantes em um fundo escuro. TIFFs de paleta e branco-é-zero precisam de uma conversão explícita. Para segmentação volumétrica, pintura celular multicanal ou modelos específicos de tecido, projete um pipeline separado e valide essas suposições em vez de projetar ou dividir as imagens silenciosamente.

A aplicação e o manual oficiais permanecem 4.2.8. O PyPI publica 4.2.8.1; seus sete módulos usados aqui e o módulo Threshold incorporado correspondem ao código-fonte 4.2.8, mas esta revisão não executou essa distribuição nativa. Mantenha o ambiente auxiliar separado da pilha de dependências mais antiga do CellProfiler; consulte a referência de tempo de execução para o limite de verificação.

Fluxo de Trabalho

1. Estabeleça a unidade de aquisição: placa, poço, local, ponto de tempo se presente, tamanho do pixel, identidade do canal nuclear, profundidade de bits da câmera, exposição e réplica biológica. Mantenha as intensidades originais da imagem. Converta formatos proprietários explicitamente com Bio-Formats antes de usar este auxiliar.
2. Crie o manifesto CSV abaixo. image_path é absoluto ou relativo ao manifesto; IDs de amostra usam letras, dígitos, pontos, hifens ou sublinhados; IDs de amostra e combinações de placa/poço/local são únicos. Use um ID de amostra não numérico como sample_001: LoadData infere tipos de coluna e, de outra forma, pode transformar 001 em 1. Evite espaços em branco circundantes nos identificadores. TIFFs devem ser uint8 ou uint16, plano/série/resolução única e não constantes. O auxiliar rejeita imagens RGB, pilhas z e imagens float em vez de adivinhar canais.
3. Use assets/nuclei.cppipe como um pipeline inicial: LoadData → IdentifyPrimaryObjects → medições de intensidade/tamanho → sobreposição de contorno → exportação CSV. O intervalo de diâmetro inicial é de 8–80 pixels, com limiarização global de Otsu, sem suavização de limiar e objetos de borda excluídos. Calibre este intervalo a partir de imagens representativas e do tamanho de pixel da aquisição antes de comparar condições.
4. Execute um pequeno piloto abrangendo controles, baixa/alta densidade, imagens escuras e bordas da placa. Inspecione as sobreposições salvas em busca de núcleos perdidos, divisões, junções e exclusões de borda. Ajuste a limiarização e o declumping no CellProfiler, exporte o .cppipe ajustado e passe --pipeline para preservá-lo. Não escolha configurações separadamente para cada tratamento para fazer suas contagens concordarem.
5. Congele o pipeline ajustado e analise o lote. Revise os avisos de saturação de entrada, contagens zero, distribuições de contagem/área e comportamento do controle. A agregação para inferência pertence ao nível da réplica biológica; milhares de células de um poço não são poços independentes.

Execute o ensaio delimitado

A partir deste diretório de habilidade, crie images.csv:

sample_id,image_path,plate,well,site
control_A01_1,images/control_A01_1_DAPI.tif,Plate1,A01,1

python scripts/nuclei_assay.py prepare images.csv load_data.csv
python scripts/nuclei_assay.py run images.csv results --executable cellprofiler
python scripts/nuclei_assay.py summarize results

run requer um diretório de saída novo/vazio e executa o CellProfiler com -c -r, uma cópia salva do pipeline, --data-file, pasta de saída e --done-file. O sucesso requer código de saída zero, um marcador Complete e tabelas de medição válidas. Ele registra o comando, o checksum do pipeline, os checksums das imagens de entrada e o QC da amostra em assay_qc.json antes da execução, retendo o status failed e o erro se a execução ou a validação da saída falharem. A saída do CellProfiler vai para cellprofiler.log. Execute novamente em uma nova pasta de saída. summarize verifica o conteúdo do CSV independentemente; ele não prova que uma execução do motor foi concluída.

Pipelines personalizados devem preservar DNA, Nuclei, Metadata_Sample, dimensionamento de tipo inteiro e o contrato de exportação de Image.csv/Nuclei.csv de objeto único sem prefixo. Mantenha as medições de intensidade/área necessárias. Um conjunto de objetos renomeado ou uma escala de intensidade diferente precisa de uma adaptação auxiliar correspondente, não de uma substituição --pipeline não verificada.

O executável também pode ser o lançador da aplicação CellProfiler ou um lançador de contêiner local; consulte references/runtime-and-qc.md para o destino do contêiner,

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