Análise de MAGeCK pooled-screen

Quando usar

Use esta funcionalidade para contar reads de sequenciamento existentes contra uma biblioteca de guias fornecida ou comparar telas já contadas. Fornece a matriz de contagem, QC, resultados de guias e genes, proveniência de contraste e uma breve interpretação de enriquecimento/depleção. Este fluxo de trabalho analisa telas; ele não projeta guias nem infere a função gênica apenas a partir de um hit.

Tempo de execução

A instalação de origem testada e a ressalva de tempo de execução externo estão em references/runtime.md. Verifique ambos mageck --version e mageck test --help antes de uma análise. O script auxiliar Python incluído usa apenas a biblioteca padrão. O próprio MAGeCK também precisa de NumPy, SciPy e o binário RRA. A geração de relatórios em PDF/R é opcional e não é necessária pelo script auxiliar.

O diretório oficial de lançamentos ainda lista 0.5.9.5 como sua versão mais recente do MAGeCK. O upstream agora vincula o projeto MAGeCK2 separado; estes comandos e o script auxiliar visam o MAGeCK 0.5.9.5, não uma instalação MAGeCK2 intercambiável. Este é um fluxo de trabalho CLI local com nenhuma API de serviço ou autenticação.

Fluxo de trabalho

1. Estabeleça a versão da biblioteca, modalidade de perturbação, nomes das amostras, direção da seleção, repicates biológicos, material de referência, ponto de tempo e lote. Separe as lanes de sequenciamento de repicates biológicos independentes. Uma referência de plasmídeo e uma referência de dia zero da célula respondem a perguntas diferentes. Exija um contraste explícito de tratamento/controle; o script auxiliar nunca atribui silenciosamente todas as amostras não utilizadas ao grupo de controle.
2. Valide uma biblioteca TSV sem cabeçalho contendo ID da guia, sequência de DNA, gene. IDs e sequências devem ser únicos. O script auxiliar requer um cabeçalho de tabela de contagem começando sgRNA, Gene, seguido por nomes de amostra não numéricos únicos como c1. O MAGeCK pode interpretar nomes numéricos como índices de coluna ou valores de contagem; renomeie-os antes da análise. IDs de guia/gene não devem ter espaços em branco. O script auxiliar rejeita sequências ambíguas e qualquer correspondência de ID de contagem/biblioteca ou gene; resolva guias multi-alvo intencionais explicitamente no upstream. Estas são restrições deliberadas do script auxiliar; o MAGeCK nativo também aceita outras variantes de entrada.
3. Para FASTQ, inspecione a estrutura dos reads e as sequências de guias conhecidas para estabelecer o trimming e a orientação. Use o MAGeCK count, com um argumento separado por espaço para cada amostra biológica; junte as lanes com vírgula apenas quando forem repicates técnicos da mesma amostra. Preserve evidências de reads não mapeados e resumo de contagem quando o mapeamento for ruim. Uma guia com contagem zero permanece na biblioteca; não a remova para melhorar o QC.
4. Execute o QC antes do teste estatístico. Revise a representação da biblioteca, reads medianos por guia, frações de zero, coeficientes de Gini e correlações de repicates dentro da condição. As bandeiras de 10% de zero e 0,8 de correlação do script auxiliar são prompts de revisão, não limiares universais de aceitação. Alta correlação pode coexistir com artefatos sistemáticos. A profundidade de leitura não é a cobertura celular experimental. O script auxiliar usa um Gini de população de contagem bruta; o Gini nativo do MAGeCK de resumo de contagem usa log(contagem + 1) com uma correção de amostra finita. Não compare seus valores ou limiares como a mesma estatística.
5. Escolha a normalização com base na tela. A normalização mediana assume que a maioria das guias é estável. Para um forte desvio global, guias de controle negativo validadas fornecidas podem suportar --normalization control. Estas devem ser IDs de guias, uma por linha; uma lista de genes não é intercambiável. Amostras de controle biológico e guias de controle negativo servem papéis diferentes. Pelo menos dois controles devem estar presentes, e cada guia atribuída a um gene de controle deve ser designada como controle. Fornecer --control-guides também altera a distribuição nula do RRA, mesmo com normalização mediana. Registre sua origem e verifique sua distribuição de contagem. O MAGeCK 0.5.9.5 muda a normalização mediana para escalonamento de contagem total para uma mediana zero ou mais de 45% de guias zero em qualquer amostra selecionada; para normalização de controle, ele avalia o subconjunto de guias de controle. Verifique o método aplicado no relatório, os fatores de tamanho e os avisos.
6. Use test para uma comparação de dois grupos. --paired requer ambas as listas em ordem biológica correspondente e comprimento igual; comprimentos correspondentes sozinhos não estabelecem o pareamento. O script auxiliar relata genes no FDR solicitado em ambas as direções e retém classificações completas.

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