Design e especificidade de primers

Produza primers candidatos na orientação 5-linha-para-3-linha, com o template exato, química, produtos pretendidos e escopo de busca por trás de cada conclusão. Calcule quantidades dependentes de sequência com as ferramentas fornecidas. Um nome de gene familiar, uma boa penalidade do Primer3 ou um único alinhamento BLAST não podem estabelecer a especificidade do primer.

Escolha o fluxo de trabalho

As ferramentas locais suportam primers emparelhados com núcleos ACGT inequívocos. Tipos de ensaio avançados têm orientação substantiva de design e validação, mas não são silenciosamente reduzidos a PCR comum. Esta habilidade projeta ensaios; normalização de expressão, validação diagnóstica experimental e design de RNA guia são tarefas separadas.

Estabeleça o contrato do ensaio

Obtenha o que muda o resultado; use suposições provisórias explícitas para um design exploratório e identifique-as no relatório:

• Propósito e template: DNA genômico, cDNA, plasmídeo ou outro substrato definido; organismo alvo, acesso com versão, liberação da montagem/transcrito, fita, isoformas desejadas e faixa de tamanho do produto. Nomeie templates desejados e indesejados.
• Evidência de sequência: FASTA local mais fonte/data de recuperação e seu hash SHA-256. Um trecho de locus usa coordenadas locais; registre seu mapeamento para a referência completa. Inclua paralogs relevantes, pseudogenes, contigs alternativos, isoformas de transcrito, esqueleto do vetor e sequência do hospedeiro na tela apropriada.
• Condições da reação: polimerase/tampão, sal monovalente, sal divalente total, dNTP total e concentrações de primer. Primer3 usa mM para sais/dNTP e nM para DNA. Registre a concentração inicial da reação separadamente do parâmetro de concentração de primer de anelamento efetivo do Primer3. Os padrões do motor são suposições.
• Restrições: intervalo alvo, regiões de ligação permitidas/excluídas, junções, exclusões de variantes e sua origem, primers fixos, caudas ou associação multiplex. Não adivinhe os limites dos éxons nem substitua silenciosamente outra montagem.
• Definição de um resultado aceitável: referências off-target relevantes, comprimentos de amplicons, limites de busca de incompatibilidade, controles e validação experimental apropriada ao ensaio. Não existe um corte termodinâmico universal que valide todas as PCRs.

Use input-contract.md para esquemas de arquivos e exemplos de coordenadas. Copie assay-report-template.md para o diretório de análise para coletar evidências. A recuperação de referência pode ser manual ou através de uma API de sequência estabelecida; preserve o acesso/versão e verifique a sequência retornada. Os scripts fornecidos usam arquivos locais e não enviam sequências online.

Instalar e verificar

Defina SKILL_DIR para o diretório instalado real desta habilidade. Trabalhe em um diretório de análise separado para que ambientes, bancos de dados de referência e resultados não entrem na habilidade.

uv venv --python 3.13 .venv-primer
uv pip install --python .venv-primer/bin/python -r "$SKILL_DIR/assets/requirements.txt"
.venv-primer/bin/python "$SKILL_DIR/scripts/design_primers.py" --help

Use o Scripts/python.exe do ambiente no Windows. Os exemplos de design/termodinâmica visam o primer3-py 2.3.1, testado com Python 3.13. Para o motor BLAST opcional, instale o NCBI BLAST+ de sua distribuição oficial e verifique:

blastn -version
makeblastdb -version

Verificações de integração local também exercitam o BLAST+ 2.17.0; outras versões exigem a verificação de sua saída e comportamento de busca antes de reivindicar cobertura equivalente.

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