QIIME 2 amplicons 16S pareados

Use para um ensaio 16S pareado e desmultiplexado com primers conhecidos, codificação de qualidade, comprimento de inserção esperado e metadados de amostra. Este fluxo de trabalho delimitado importa leituras, remove primers 5', faz denoising com DADA2, classifica ASVs usando um classificador explicitamente fornecido e retém a proveniência .qza/.qzv. Não trate contagens de leitura como contagens celulares absolutas ou atribuições de taxonomia como identificação de cepa.

Estabeleça o ensaio antes de executar

• Confirme Phred+33, orientação da leitura, sequências de primer como sequenciadas nas leituras forward/reverse, e se os primers já foram removidos. O runner empacotado requer primers ainda presentes nas extremidades 5'; ele ancora a correspondência do Cutadapt e descarta pares não cortados. Leituras já cortadas precisam de um fluxo de trabalho direto de importação → DADA2 com essa omissão registrada na proveniência.
• Escolha posições de truncamento a partir de perfis reais de qualidade e erro por base. trunc-f/r são posições após a remoção do primer. O comprimento máximo de inserção esperado também exclui primers. Exija trunc_f + trunc_r - maximum_insert_length >= 12; use uma margem para variação de comprimento. A verificação prevê sobreposição geométrica, não fusão biológica bem-sucedida.
• Escolha um classificador cujo banco de dados de referência, cobertura taxonômica, orientação e abordagem de treinamento se encaixem no ensaio. Classificadores de comprimento total são suportados; treinamento específico da região do primer não é obrigatório. Combine sua versão do scikit-learn exatamente com o ambiente instalado (a distribuição oficial de 2026.7 fixa 1.7.1). Registre o URL de origem, a versão do banco de dados e o checksum. A página atual de recursos de dados do QIIME vincula classificadores hospedados externamente para 2026.4 e posteriores; seus downloads mais antigos não são automaticamente compatíveis. Não busque automaticamente um classificador "mais recente" arbitrário ou reutilize um modelo sklearn serializado incompatível. Carregue artefatos de classificador sklearn apenas de fontes confiáveis: a validação de formato QZA não torna um modelo serializado não confiável seguro.
• Inclua brancos de extração, negativos de PCR e uma comunidade simulada onde disponível. O runner rejeita FASTQs vazios; preserve IDs de controle vazios separadamente e relate-os em vez de excluir silenciosamente evidências de controle. Avalie a contaminação antes da interpretação ecológica.

Arquivos de entrada

Manifest é um arquivo PairedEndFastqManifestPhred33V2 separado por tabulação com exatamente estes cabeçalhos:

sample-id	forward-absolute-filepath	reverse-absolute-filepath
sample1	/data/sample1_R1.fastq.gz	/data/sample1_R2.fastq.gz

Este é o perfil de manifest deliberadamente restrito do helper. Use caracteres de tabulação reais, caminhos absolutos literais visíveis para o runtime (expanda variáveis de ambiente antes de chamar este helper) e uma linha por amostra; sem linhas de comentário/diretiva ou colunas adicionais neste manifest. Não inverta o complementar dos arquivos R2. Metadados de amostra são um arquivo separado por tabulação com a primeira coluna sample-id, IDs únicos correspondendo ao manifest, e anotação opcional #q2:types. Inclua covariáveis e IDs de réplicas biológicas necessários posteriormente. O helper verifica IDs de metadados e estrutura de linhas; o QIIME realiza a tipagem completa de metadados/validação de diretivas durante a execução. Metadados usados por ações persistem na proveniência do artefato, portanto, use IDs de réplicas biológicas desidentificados.

Executar

O helper está em scripts/amplicon_workflow.py. Os comandos abaixo assumem que o diretório de habilidades é o diretório de trabalho. Primeiro, valide sem QIIME. Estes primers e comprimentos de exemplo são ilustrativos, não configurações de ensaio universais:

python scripts/amplicon_workflow.py validate \
  --manifest manifest.tsv --metadata sample-metadata.tsv \
  --primer-f GTGYCAGCMGCCGCGGTAA --primer-r GGACTACNVGGGTWTCTAAT \
  --trunc-f 220 --trunc-r 200 --amplicon-max 300

Em seguida, execute no ambiente QIIME 2 2026.7 com um classificador compatível. Esta invocação específica do estudo é ilustrativa; escolha comprimentos usando uma inspeção de qualidade prévia ou piloto:

python scripts/amplicon_workflow.py run \
  --manifest manifest.tsv --metadata sample-metadata.tsv \
  --primer-f GTGYCAGCMGCCGCGGTAA --primer-r GGACTACNVGGGTWTCTAAT \
  --trunc-f 220 --trunc-r 200 --amplicon-max 300 \
  --classifier compatible-classifier.qza --threads 4 --output run01

run executa imediatamente, escreve apenas em um novo diretório de saída e para em um comando QIIME falho. Ele transmite por cada registro FASTQ pareado para capturar IDs/ordem/contagens incompatíveis,

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